Replication Combing Assay (RCA)
Pour l’analyse spatio-temporelle de la réplication de l’ADN
Visualisation directe des origines de réplication actives et études de la cinétique de la réplication sur de longues molécules d’ADN
Répondez à diverses questions sur la réplication sur des fibres d’ADN individuelles en une seule expérience
Étudier le taux d’initiation (nombres d’origines actives/longueur totale des molécules d’ADN)
Déterminer de la vitesse de progression des fourches de réplication
En combinaison avec l’hybridation in situ par fluorescence, analyser du motifs des origines actives et de la cinétique au niveau de la région d’intérêt
Cartographier des origines
Mesurer l’efficacité de l’origine
Exemple de visualisation de multiples origines de réplication sur de longues fibres d’ADN peignées
Études dynamiques de la réplication et de la réparation de l’ADN
Le peignage moléculaire est une approche puissante et précise permettant de suivre les caractéristiques à la fois spatiales et temporelles de la réplication de l’ADN en une seule expérience. La réplication peut être visualisée directement grâce aux techniques d’immunofluorescence sur les molécules d’ADN peignées. Cela suppose un marquage double de l’ADN en cours de réplication avec des nucléotides modifiés. Selon le marquage utilisé, les séquences répliquées tôt ou tardivement dans chaque molécule peuvent être distinguées sous forme de segments fluorescents alternant entre le vert et le rouge.
Nous avons mis au point un protocole expérimental, le Replication Combing Assay (RCA), pour l’analyse des profils de réplication sur des molécules d’ADN de longueur comparable. Ce test unique facilite l’étude des distributions globales des origines et des taux d’élongation au niveau des fourches pendant la division cellulaire normale ou anormale. Plusieurs sites d’initiation sur la même molécule d’ADN peuvent être surveillés, à la fois sur le plan spatial et temporel, directement sur l’ADN peigné. Le programme de réplication survenant dans des régions génétiques spécifiques peut être déterminé en exécutant simultanément une détection de sondes fluorescentes hybridées pour la région d’intérêt et des nucléotides modifiés incorporés.
Notre protocole standardisé utilisé avec la plateforme de peignage moléculaire favorise les études reproductibles et offre des résultats exacts et rapides.
Fonctionnement
Les cellules répliquées sont incubées avec des nucléotides halogénés (IdU et CldU)
À des stades précis durant l’incubation, des échantillons de cellules sont retirés et leur ADN est isolé et soumis à un peignage moléculaire avant l’analyse.
Représentation schématique des signaux provenant de deux marquages pulsés, l’un avec de l’iododeoxyuridine (IdU) et l’autre du chloro-deoxyuridine (CldU).
Les fourches de réplications progressent de façon bidirectionnelle à un même rythme à partir de l’origine et incorporent les analogues formant ainsi une bulle de réplication symétrique. Après détection de l’IdU et du CldU, trois types de signaux peuvent être obtenus:
(1) Les initiations qui se produisent avant le démarrage du marquage pulsé:
un signal vert et un signal rouge avec un écart entre les deux segments verts
(2) Les origines qui démarrent de façon simultanée au premier marquage pulsé
Un signal de double couleur avec un segment vert continu
(3) Les origines qui démarrent de façon simultanée au second marquage pulsé
Un signal unique et isolé rouge
Un signal rouge continu encadré par deux signaux verts peut se former à la suite d’une fusion entre deux fourches dont les origines respectives sont adjacentes.
Applications liées à la découverte de médicaments anticancéreux et au test d’efficacité des composés pilotes
Une analyse complète des profils de réplication dans des conditions génétiques et physiologiques choisies peut faciliter l’identification de médicaments prometteurs destinés au traitement du cancer. Grâce au Replication Combing Assay qui permet d’évaluer l’efficacité des molécules anticancéreuses et de détecter l’instabilité génomique, les laboratoires pharmaceutiques peuvent avoir accès à une approche innovante et hautement performante pour tester leurs composés pilotes.
